Płytka 96 Wells Wysoka precyzja i specyficzność Zestaw Mouse Netrin-1 ELISA Dostosowany

Płytka 96 Wells Wysoka precyzja i specyficzność Zestaw Mouse Netrin-1 ELISA Dostosowany

Nr kat. E 1802Mo

Standardowy zakres krzywej : 0,5ng / L - 200ng / L

Czułość : 0,38 ng / L

Rozmiar : 96 dołków

P recyzja

Dokładność w ramach testu (dokładność w teście) Trzy próbki o znanym stężeniu przetestowano na jednej płytce w celu oceny precyzji wewnątrz testu.

Dokładność między testami (dokładność między testami) Trzy próbki o znanym stężeniu testowano w oddzielnych testach w celu oceny precyzji między testami.

CV (%) = SD / średnia x 100

Test wewnętrzny: CV <8%

Inter-Assay: CV <10%

Ntend U se

Ten zestaw kanapkowy służy do dokładnego wykrywania ilościowego myszy Netrin-1 (znanej również jako Ntn1) w surowicy, osoczu, nadsączach hodowli komórkowych, lizatach komórkowych, homogenatach tkankowych.

Powiązanie

Ten zestaw jest testem immunoenzymatycznym (ELISA). Płytkę wstępnie powleczono przeciwciałem Mysz Ntn1. Ntn1 obecny w próbce jest dodawany i wiąże się z przeciwciałami pokrytymi w studzienkach. Następnie dodaje się biotynylowane przeciwciało mysi Ntn1 i wiąże się z Ntn1 w próbce. Następnie dodaje się Streptawidynę-HRP i wiąże się z biotynylowanym Ntn1antibody. Po inkubacji niezwiązana Streptawidyna-HRP jest wymywana podczas etapu przemywania. Następnie dodaje się roztwór substratu i kolor rozwija się proporcjonalnie do ilości MouseNtn1. Reakcję zakończono przez dodanie kwaśnego roztworu zatrzymującego i zmierzono absorbancję przy 450 nm.

Kolekcja próbek

Surowica Pozwól surowicy skrzepnąć przez 10-20 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 2000-3000 obr / min przez 20 minut.

Osocze Zdobywaj osocze, używając EDTA lub heparyny jako antykoagulantu. Wirować próbki przez 15 minut przy 2000-3000 obrotów na minutę w temperaturze 2 - 8 ° C w ciągu 30 minut od pobrania.

Mocz zbierać sterylną rurką. Wirować przy 2000-3000 obr / min przez około 20 minut. Podczas gromadzenia płynu ustno-otrzewnowego i płynu mózgowo-rdzeniowego należy postępować zgodnie z wyżej wymienionymi procedurami.

Komórka C u poz ą ę su-dernatant Gromadzić za pomocą sterylnych probówek podczas badania wydzielanych składników. Wirować przy 2000-3000 obr / min przez około 20 minut. Zbierz ostrożnie supernatanty. Podczas badania składników w komórce należy użyć PBS (pH 7,2-7,4), aby rozcieńczyć zawiesinę komórek do stężenia komórek około 1 miliona / ml. Uszkadzaj komórki przez powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, aby wypuścić składniki wewnętrzne. Wirować przy 2000-3000 obr / min przez około 20 minut.

Tkankowe inne płyny ustrojowe Wypłucz tkanki w PBS (pH 7,4), aby dokładnie usunąć nadmiar krwi i zważ przed homogenizacją. Mielimy tkanki i homogenizujemy je w PBS (pH 7,4) za pomocą szklanego homogenizatora na lodzie. Rozmrozić w 2-8 ° C lub zamrozić w temperaturze -20 ° C. Wirować przy 2000-3000 obr / min przez około 20 minut.

Uwaga

• Stężenia próbek należy przewidzieć przed użyciem w teście. Jeśli stężenie próbki nie mieści się w zakresie krzywej standardowej, użytkownicy muszą skontaktować się z nami w celu określenia optymalnej próbki do swoich konkretnych eksperymentów.
• Próbki, które należy zużyć w ciągu 5 dni, należy przechowywać w temperaturze 2-8 ° C. Próbki powinny być dzielone na równe objętości lub muszą być przechowywane w temperaturze -20 ° C w ciągu 1 miesiąca lub -80 ° C w ciągu 6 miesięcy. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
• Próbki powinny zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem testu.
• Odwiruj, aby pobrać próbkę przed użyciem.
• Próbki zawierające NaN3 nie mogą być testowane, ponieważ hamują aktywność peroksydazy końskiej (HRP).
• Zbierz ostrożnie supernatanty. Gdy podczas przechowywania wystąpiły osady, należy powtórzyć odwirowanie.
• Hemoliza może znacznie wpłynąć na ważność wyników testu. Uważaj, aby zminimalizować hemolizę.

* Nie można rozcieńczać tego zestawu. Ze względu na materiał, którego używamy do przygotowania zestawu, zakłócenie matrycy próbki może fałszywie obniżyć swoistość i dokładność testu.

P ragmentacja P

Przed użyciem wszystkie odczynniki należy doprowadzić do temperatury pokojowej.

Standard Odtworzyć 120 μl wzorca (240ng / L) z 120 μl standardowego rozcieńczalnika w celu wytworzenia standardowego roztworu podstawowego o stężeniu 120ng / L. Odstawić standard na 15 minut z delikatnym mieszaniem przed rozcieńczeniem. Przygotuj zduplikowane standardowe punkty, seryjnie rozcieńczając standardowy roztwór podstawowy (120ng / L) 1: 2 przy użyciu standardowego rozcieńczalnika, aby uzyskać roztwory o stężeniu 60ng / L, 30ng / L, 15ng / L i 7,5ng / L. Standardowy rozcieńczalnik służy jako zerowy standard (0 ng / L). Pozostały roztwór należy zamrozić w temperaturze -20 ° C i zużyć w ciągu jednego miesiąca. Proponowane rozcieńczenia roztworów standardowych są następujące:

Bufor do przemywania Rozcieńczyć 20 ml koncentratu buforu płuczącego 30x do wody dejonizowanej lub destylowanej, aby uzyskać 500 ml 1x buforu do przemywania. Jeśli w koncentracie utworzyły się kryształy, delikatnie mieszaj, aż kryształy całkowicie się rozpuści.

P Rocedura

1. Przygotuj wszystkie odczynniki, roztwory standardowe i próbki zgodnie z instrukcją. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy doprowadzić do temperatury pokojowej. Test przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

2. Określ liczbę pasków wymaganych do testu. Wstaw paski w ramkach do użycia. Niewykorzystane paski należy przechowywać w temperaturze 2-8 ° C.

3. Dodać 50 μl wzorca do standardowej studzienki. Uwaga : Nie dodawaj przeciwciał do standardowej studzienki, ponieważ roztwór wzorcowy zawiera biotynylowane przeciwciało.

4. Dodaj 40 μl próbki do dołków do próbek, a następnie dodaj 10 μl przeciwciała anty-Ntn1 do dołków do próbek, a następnie dodaj 50 μl streptawidyny-HRP do dołków do próbek i standardowych dołków (niezawierająca pustej studzienki kontrolnej). Dobrze wymieszaj. Przykryj płytę uszczelniaczem. Inkubować 60 minut w 37 ° C.

5. Usuń uszczelniacz i przemyj płytkę 5 razy buforem do przemywania. Namoczyć studzienki za pomocą co najmniej 0,35 ml buforu do płukania przez 30 sekund do 1 minuty na każde płukanie. W celu zautomatyzowanego mycia odessać wszystkie studzienki i przemyć 5-krotnie buforem do przemywania, przepełniając dołki buforem do przemywania. Wymieszać płytkę na ręcznikach papierowych lub innym chłonnym materiale.

6. Dodaj 50 μl roztworu substratu A do każdej studzienki, a następnie dodaj 50 μl roztworu substratu B do każdej studzienki. Inkubować płytkę pokrytą nowym uszczelniaczem przez 10 minut w temperaturze 37 ° C w ciemności.

7. Dodaj 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, niebieski kolor natychmiast zmieni kolor na żółty.

8. Określ gęstość optyczną (wartość OD) każdej studzienki natychmiast za pomocą czytnika mikropłytek ustawionego na 450 nm w ciągu 10 minut po dodaniu roztworu zatrzymującego.

Referances

"Netryna-1 działa jako czynnik przetrwania poprzez swoje receptory UNC5H i DCC."
Llambi F., Causeret F., Bloch-Gallego E., Mehlen P.
EMBO J. 20: 2715-2722 (2001)